農業環境科學學報 2009,28(3):597-601 Journal of Agro-Environment Science

聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦不同生長階段及 餌料藻類的安全性研究

王 群，劉 淇，李 峰，李 健

（中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東 青島 266071）

摘 要：采用藥浴方式，研究了一種新型消毒劑—聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦受精卵、無節幼體、幼蝦、成蝦的毒性及餌料藻類的影響。結果表明，聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦幼蝦 24、48 h 的LC50  為 64.1 mg·L-1  和 31.13 mg·L-1，安全濃度 Sc 為 2.20 mg·L-1；聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦成蝦 24、48 h 的LC50  為 66.17 mg·L-1  和 32.16 mg·L-1，安全濃度 Sc 為 2.28 mg·L-1，為了保證凡納濱對蝦的安全性，聚六亞甲基雙胍的用量應控制在 0.5 mg·L-1  之內；聚六亞甲基雙胍在 125 mg·L-1  濃度內對受精卵的孵化率無明顯影響，0.5 mg·L-1  濃度以內對無節幼體的變態率無明顯影響。聚六亞甲基雙胍對球等鞭金藻和亞心形扁藻表現出了明顯的劑量-效應關系，其對球等鞭金藻和亞心形扁藻的生長不產生抑制的最高濃度為 5 mg·L-1；聚六亞甲基雙胍對球等鞭金藻 48、96、144 h 的 EC50  為 27.01、34.95 mg·L-1  和 33.14 mg·L-1；亞心形扁藻為 34.65、28.73 mg·L-1  和 20.57 mg·L-1，聚六亞甲基雙胍對兩種藻類的安全濃度分別 3.5 mg·L-1  和 2.9 mg·L-1，表明聚六亞甲基雙胍對亞心形扁藻的影響更明顯。

關鍵詞：凡納濱對蝦；聚六亞甲基雙胍；餌料藻類；安全性

中圖分類號：X592 文獻標志碼：A 文章編號：1672- 2043(2009)03- 0597- 05

Security on Different Growth Stages of Litopenaeus vannamei and Feeding Algae of Polyhexamethylene Biguanide（PHMB）

WANG Qun, LIU Qi, LI Feng, LI Jian

（Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China） Abstract：The security of polyhexamethylene biguanide（PHMB）on different growth stages of Litopenaeus vannamei and feeding algae were in－ vestigated. The results showed：cumulative mortality of juvenile and adult Litopenaeus vannamei increased with increasing concentration of PHMB. 24 h and 48 h median lethal concentrations（LC50）of PHMB on juvenile shrimp of  Litopenaeus vannamei were 64.1  mg·L-1  and

31.13 mg·L-1, and security concentration（Sc）was 2.20 mg·L-1. 24 h and 48 h median lethal concentrations（LC50）of PHMB on adult shrimp of Litopenaeus vannamei were 66.17 mg·L-1  and 32.16 mg·L-1, and security concentration（Sc）was 2.28 mg·L-1. In order to guarantee security on culturing Litopenaeus vannamei, the using amount of PHMB should below 0.5 mg·L-1. Hatching and metamorphosis test showed：hatching rate of control group was 87%, and hatching rate of test group was the range of 79%~92%. There was no significant influence on hatching rate of zygote when the concentration of PHMB below 125 mg·L-1, and there was no significant influence on metamorphosis rate of nauplius when the concentration of PHMB below 0.5 mg·L-1. With the increase of PHMB concentration, the growth inhibition rate of Isochrysis galbana and Platymonas subcordiformis was increasingly apparent. There was an excellent relationship between dose and effect of PHMB on Isochrysis galbana and Platymonas subcordiformis, and the sensitivity of Platymonas subcordiformis to PHMB is higher than Isochrysis galbana. The highest concentration of no significant influence of PHMB on Isochrysis galbana and Platymonas subcordiformis was 5 mg·L-1. 48 h, 96 h and 144 h EC50  of PHMB on Isochrysis galbana were 27.01, 34.95 mg·L-1  and 33.14 mg·L-1, and the corresponding concentrations of Platymonas

subcordiformis were 34.65，28.73 mg·L-1  and 20.57 mg·L-1. According to the classification of aquatic organisms toxicity, the toxicity of PHMB to Isochrysis galbana and Platymonas subcordiformis belonged to moderate toxicity.

Keywords：Litopenaeus vannamei; polyhexamethylene biguanide（PHMB）; feeding algae; security

收稿日期：2008-05-07

基金項目：國家科技支撐計劃“工程化養殖高效生產體系構建技術研究與開發”（2006BAD09A03）；公益性行業科研專項“對蝦養殖管理信息系統研究與建立”（nyhyzx07-042）

作者簡介：王  群（1973—），女，山東蓬萊人，博士，副研究員，從事水產藥理學研究。E-mail：[email protected]

通訊作者：李  健  E-mail：[email protected]

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王 群等：聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦不同生長階段及餌料藻類的安全性研究

2009 年 3 月

近年來，含氯消毒劑在防治對蝦細菌性疾病方面發揮了巨大的作用[1-3]。但這些含氯消毒劑存在溶解性差、刺激性強和安全性不好等副作用，使用時其使用效果往往受水體中酸堿度和有機物的影響，聚六亞甲基雙胍（polyhexamethylene biguanide，PHMB）屬于陽離子表面活性劑，無色無味、易溶于水、性質穩定，殺菌過程中不發生強氧化反應，通過細胞內產生沉淀作用及細胞內磷的數量上升，阻礙細胞壁與核酸的合成[4-5]，由于其獨特的結構和性能，在食品行業、環境消毒等方面得到了應用[6-7]；近年來，在水產養殖行業也得到一定程度的應用[8-9]。

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）又名南美白對蝦，具有生長快、抗病力強等優點，1988   年從美國夏威夷引進我國，1992   年人工繁殖獲得成功，目前占我國對蝦養殖產量的 70%左右。本文采用藥浴方式研究聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦受精卵、無節幼體、幼蝦、成蝦的安全性及餌料藻類的影響，評價聚六亞甲基雙胍對對蝦的毒性效應及生態毒理學效應，為藥物合理安全使用提供必要的參考數據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

聚六亞甲基雙胍（含量 20%），試驗中的數據已換算為純的聚六 亞甲基雙胍表示。

球等鞭金藻、亞心形扁藻由中國水產科學研究院黃海水產研究所提供。

凡納濱對蝦及其受精卵、無節幼體由青島卓越水產養殖股份公司提供。

凡納濱對蝦幼蝦和成蝦購自青島南山市場。

1.2 聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦幼蝦和成蝦的急性毒性試驗

采用半靜水法藥浴方式，24 h 更換 100％試液，試

1.3 聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦受精卵和無節幼體毒性試驗

1.3.1 凡納濱對蝦受精卵孵化率的影響試驗

將受精卵放入配制好的不同濃度聚六亞甲基雙胍溶液中浸泡一定時間后，用 100 目篩絹濾掉消毒劑溶液，然后用干凈的海水充分沖洗去除殘留在受精卵表面的消毒劑；再放入盛有 300 mL 孵化水的燒杯中孵化，每個燒杯放入 30 粒受精卵，每組 90 粒。試驗水溫 27~28 ℃，pH 8.0，鹽度 31。試驗過程中不充氣，不換水，24 h 后對孵化出的無節幼體進行計數。采用 χ2檢驗比較試驗組和對照組受精卵孵化率的顯著性差異。

1.3.2 凡納濱對蝦無節幼體變態率的影響試驗

試驗在 500 mL 玻璃燒杯中進行，將凡納濱對蝦無節幼體分別放入盛有已配制好的 400 mL 不同濃度聚六亞甲基雙胍溶液的燒杯中，觀察記錄 40 h 各組無節幼體變為蚤狀幼體的情況。每個燒杯中放入 50 尾無節幼體，每組 150 尾。試驗水溫 28~30 ℃，pH8.0，鹽度 31。試驗過程中不充氣，不換水。

1.4 聚六亞甲基雙胍對餌料藻類的影響試驗

根據預試驗結果設計正式試驗中聚六亞甲基雙胍的濃度，試驗濃度梯度按等對數間距設置；試驗設空白對照組，每組設 3 個平行重復。將處于指數生長期的藻種用藻類培養液調整為適宜濃度，分裝在 250 mL 經干熱滅菌的錐形瓶中（200 mL·瓶-1），初始濃度為（3.08±0.14）×104  個·mL-1；然后加入聚六亞甲基雙胍系列標準液，使藻液中的聚六亞甲基雙胍的濃度為0、5、10、20、40、80、160 mg·L-1，每個濃度設 3 個平行重復，混勻后自然光 24 h 恒溫（20±1）℃培養，每日振蕩 3~4 次。每間隔 48 h 用顯微鏡觀察藻細胞狀態，并按帕森斯等[10]的方法采集樣本，在血球計數板上計 數，取算數平均值。

用生長面積法[11]計算 96 h EC50：

驗均設平行重復。凡納濱對蝦幼蝦體長 4.6~5.5 cm，

IA=（AC-A）t

/AC×100%

成蝦體長 11.3 ~12.7 cm，海水 pH8.0，鹽度 31，水溫

25.1~26.2 ℃，動物數量 30 尾·組-1，設平行重復；試驗過程中不充氣。

試驗中觀察記錄 24、48 h 死亡數。毒性試驗結果用半數致死濃度（LC50）和安全濃度（Sc）表示；半數致死濃度（LC50）采用移動平均角法計算；安全濃度（Sc）采用下式計算：

A=（N1-N0）/2×t1+（N1  +N2-2N0）2×（t2-t1）+…+（Nn-1

+N -2N）/2×（t -t  ）

式中：IA  為生長抑制百分率；AC  為空白組生長曲線以下面積；At  為受試濃度生長曲線以下面積：A 為生長曲線下面積；Nn  為 tn  時刻細胞密度；tn  為試驗開始后第 n 次計數時間。

以 IA  為縱坐標和濃度對數為橫坐標作圖，IA =

Sc=（24

48 hLC50×0.3

50/48 hLC50）2

50%所對應的濃度即為 EC50。

安全濃度（CS）：CS  = 96 h EC

50×0.1

第 28 卷第 3 期 農 業 環 境 科 學 學 報

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2 試驗結果

2.1 聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦的急性毒性

聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦幼蝦和成蝦 24、48 h 的死亡率見表 1~表 2。凡納濱對蝦幼蝦和成蝦的死亡率隨聚六亞甲基雙胍暴露濃度的增加而增加，隨暴露時間的延長而增加。

2.2 聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦受精卵和無節幼體毒性

聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦受精卵孵化率和無節幼體變態率的影響如表 3 和表 4。對照組的孵化率為 87%，試驗組的孵化率為 79%~92%，與對照組對蝦受精卵孵化率差異不顯著（P>0.05），表明聚六亞甲基雙胍 125 mg·L-1  濃度以內處理凡納濱對蝦受精卵 10~30 min 對其孵化率無明顯影響。當聚六亞甲基雙胍的濃度為 1.0 mg·L-1，凡納濱對蝦幼體的變態率為 81%，與對照組之間差異顯著（P<0.05）；當聚六亞甲

基雙胍的濃度為 0.5 mg L-1

不同濃度聚六亞甲基雙胍對球等鞭金藻的生長抑制試驗結果見表 5。隨著聚六亞甲基雙胍質量濃度的升高，球等鞭金藻的生長受抑制愈加明顯，當聚六亞甲基雙胍的質量濃度為 80 mg·L-1  時，球等鞭金藻的生長完全受到抑制并最終導致其死亡，抑制率為100%。低質量濃度組（5 mg·L-1）的細胞生長不受抑制，48 h 的高質量濃度組（40 mg·L-1）的抑制率比低質量濃度組（10 mg·L-1）抑制率增加了 2 倍左右，96 h 和 144 h 的高質量濃度組（40 mg·L-1）的抑制率比低質量濃度組（10 mg·L-1）增加了 3 倍左右。低質量濃度組

（5、10、20 mg·L-1）隨著暴露時間的延長，細胞生長受抑制不明顯；高質量濃度組（40 mg·L-1）隨著暴露時間的延長，細胞生長受抑制越明顯，其 48、96、144 h 細胞的生長抑制率分別為 57.0%、81.8%、94.4%。聚六亞

表 4 聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦無節幼體變態率的影響

Table 4 Effect of PHMB on metamorphosis rate of nauplius

藥物濃度/mg·L-1

concentration 0 0.125  0.25    0.5 1.0 2.0 4.0 8.0

態率為 95%，與對照組之間差異不顯著（P>0.05）。

變 態 率 /% metamorphosis rate

100    100    100 95 81** 0** 0** 0**

2.3 聚六亞甲基雙胍對餌料藻類影響試驗

2.3.1 聚六亞甲基雙胍對球等鞭金藻生長抑制試驗

注：每個試驗組與空白對照組進行顯著性檢驗，表中變態率右上角的“**”表示 χ2 檢驗差異極顯著（P<0.01）。

表 1 聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦幼蝦的急性毒性試驗結果

Table 1 Toxicity of PHMB on juvenile shrimp of Penaeus vannamei

注：24 h LC50：64.1 mg·L-1，95%置信范圍為 48.09~83.02 mg·L-1；48 h LC50：31.13 mg·L-1，95%置信范圍為 25.12~38.37 mg·L-1；Sc（安全濃度）：2.20 mg·L-1。

表 2 聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦成蝦的急性毒性試驗結果

Table 2 Toxicity of PHMB on adult shrimp of Penaeus vannamei

注：24 h LC50：66.17 mg·L-1，95%置信范圍為 48.99~86.69 mg·L-1；48 h LC50：32.16 mg·L-1，95%置信范圍為 26.13~39.43 mg·L-1；Sc （安全濃度）：

2.28 mg·L-1。

表 3 聚六亞甲基雙胍對凡納濱對蝦受精卵孵化率的影響

Table 3 Effect of PHMB on hatching rate of zygote